بررسی تنوع ژنتیکی باکتری عامل لکه نواری جو در استان کرمان

بیماری لکه نواری جو یکی از مهم ترین بیماری های بذر زاد جو در مناطق گرم ومرطوب است. این بیماری اولین بار توسطjones و همکاران در سال 1917 از هند گزارش شد اما امروزه در بسیاری از نقاط جهان وجود دارد. در ایران برای اولین بار، علائم لکه نواری باکتریایی در بهار 1983 در برخی از مزارع استان کرمان مشاهده و توسط علیزاده ورحیمیان گزارش شد. این بیماری از آن پس در منطقه وجود داشته و در سال های بارانی به صورت اپیدمی در آمده است. عامل بیماری لکه نواری جو باکتری x. translucens pv. translucens می باشد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی باکتری عامل این بیماری، در طول سال 1386 از مناطق زراعی استان کرمان شامل بردسیر،جیرفت، کوهپایه، بافت، ماهان، سیرچ، زرند، کرمان(مزرعه دانشگاه ) و سیستان وبلوچستان بازدید به عمل آمد. طی بازدید از مزارع جو جیرفت، سیرچ و استان سیستان وبلوچستان (زابل وزهک) نمونه آلوده ای مشاهده نشد. عامل بیماری طبق روش های مرسوم در باکتری شناسی جداسازی و خالص سازی شد. به منظور تست بیماری زایی، جدایه های بدست آمده بر روی گیاهچه های جو تلقیح گردیدند و همه آن هاعلائم لکه نواری را ایجاد کردند. سپس خصوصیات فنوتیپی جدایه ها شامل بررسی شکل پرگنه ها روی محیطydc، رنگ آمیزی گرم، آزمون فعالیت کاتالاز، آزمون اکسیداز، تست رشد غیر هوازی، تست تولید لوان، تست تولید h2s از سیستئین، تست رشد در دمای 40 درجه سا نتی گراد، تست رشد روی محیط حاوی ttc، تست تولید اسید از کربوهیدرات ها، هیدرولیز نشاسته، تست ذوب ژلاتین، تست آرژنین دی هیدرولاز، واکنش فوق حساسیت، تست اثر روی شیر لیتموس دار، هیدرولیز کازئین و تولید اوره انجام شد که از این لحاظ پرگنه های زرد رنگ، گرد، محدب و لعاب دار باکتری ایجاد شد و جدایه های بدست آمده گرم منفی،کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی بودند. تولید گاز h2s کرده و در دمای 40 درجه رشد کردند اما قادر به رشد روی محیط حاوی ttc یک درصد نبودند. از قند های گلوکز، سوربیتول، لاکتوز، مالتوز، آرابینوز، مانوز و سلوبیوز تولید اسید کردند و واکنش آن ها باشیر لیتموس دار قلیا یی بود. تست های هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز کازئین، ذوب ژلاتین، تولید لوان و واکنش فوق حساسیت جدایه ها مثبت و تست آرژنین دی هیدرولاز و تولید اوره آن ها منفی ارزیابی شد که بر این اساس تمامی استرین های جدا شده از گیاهان جو که دارای علائم لکه نواری بودند خصوصیات بیوشیمیایی جنس xanthomonas را نشان دادند. با توجه به بذرزاد بودن عامل لکه نواری جو و انتقال بیماری از این طریق، جداسازی عامل بیماری از بذر با محیط کشت های xts و wbc صورت گرفت. بر این اساس بعد از جداسازی و کشت پاتوژن روی محیط کشت، کلونی های مخاطی و زرد رنگی روی پلیت مشاهده شد. به منظور تایید این پاتوژن جداشده به عنوان عامل بیماری لکه نواری جو، از کلونی های منفرد و خالص آزمون بیماریزایی به عمل آمد که با مشاهده علائم بیماری، بذرزاد بودن عامل بیماری تایید شد. از استرین ها دی.ان.ای استخراج گردید و با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز و به کمک یک جفت آغازگر اختصاصی این گونه (t1 و t2) از همه آن ها یک نوار دی.ان.ای به اندازه 139 جفت باز تکثیر شد. این نوار توسط شاهد منفی xanthomonas citri subsp citri تشکیل نشد. سپس با انجام rep-pcr و با استفاده از آغازگرهای box و eric تنوع ژنتیکی استرین ها ارزیابی شد. سپس توسط داده های حاصل از نوارهای دی.ان.ای به دست آمده از آغازگرها، با روش upgma درخت فیلوژنی استرین ها رسم گردید. بر اساس داده های حاصل از آغازگر box استرین ها در 9 کلاستر و بر اساس آغازگر eric در 6 کلاستر قرار گرفتند که در بین استرین های هر کلاستر نیز تنوع وجود داشت. در مطالعه انجام شده مشخص گردید، بر اساس الگوی حاصل از آغازگرهای eric و box بین استرین های باکتری x. translucens pv. translucens، تنوع وجود دارد ولی استرین های مناطق مختلف را نمی توان در گروه های مجزا قرار داد و رابطه ای بین گروه بندی ژنتیکی و منطقه جغرافیایی نمونه برداری مشاهده نگردید. جهت بررسی پروتئین های کل سلولی، استخراج پروتئین صورت گرفت. پروتئین ها در ژل پلی آکریل آمید الکتروفورز شدند. در مقایسه استرین های جدا شده از جو هیچ تفاوتی مشاهده نشد و تمامی استرین ها یکسان بودند. استرین های جدا شده از جو مشابه استرین های استاندارد g04 و g06، استرین استاندارد پاتووار translucens در کلکسیون بلژیک، بودند. همچنین آنالیز الکتروفورزی پروتئین های سلولی نشان داد که استرین استاندارد بیماریزا روی گندم (دریافت شده از کلکسیون بلژیک) در مقایسه با استرین استاندارد بیماریزا روی جو و استرین های جدا شده از جو در این تحقیق در چندین باند متفاوت بودند.